Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

PENDAHULUAN

Semakin meningkatnya teknologi rakayasa genetika memunculkan metode baru untuk mempermudah proses perbanyakan DNA, salah satunya dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR merupakan suatu metode yang banyak digunakan untuk memperbanyak DNA dengan cepat yang akan dipakai pada kloning gen, deteksi polimorfisme, diagnosis penyakit, dan lain-lain secara in vitro dengan menggunakan dua primer untai tunggal pendek (Noer & Gustiananda 1997). Dengan metode ini sejumlah kecil fragmen DNA yang diinginkan akan diamplifiksikan secara eksponensial sampai jutaan kali dalam waktu beberapa jam (Sulistyaningsih 2007).

Beberapa komponen yang diperlukan dalam PCR antara lain fragmen DNA yang akan diperbanyak (template DNA), sepasang oligonukleotida sintetik, enzim DNA polymerase yang tahan panas atau disebut juga Taq polymerase, berbagai macam nukleotida bebas atau dNTPs (dATP nukleotida berbasa Adenine, dGTP nukleotida berbasa Guanine, dCTP nukleotida berbasa Cytosine, dan dTTP nukleotida berbasa thymine), buffer yang mengandung MgCl2 reverse transcriptase, dan alat thermocycler (Sulistyaningsih 2007). Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer yang berada setelah target disebut primer reverse (Muladno 2002).

Perbanyakan DNA melalui PCR terdiri dari tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing, dan sintesis DNA. Denaturasi merupakan proses pemisahan dua untai pilinan DNA, di mana ikatan hidrogen yang menyatukan kedua pilinan tersebut lepas sehingga masing-masing akan menjadi utas tunggal dengan suhu yang biasa digunakan berkisar antara 92-96OC dalam waktu beberapa detik. Annealing merupakan proses penempelan primer (primer forward dan primer reverse) pada utas tunggal DNA, suhu yang biasa digunakan berkisar antara 40-55OC. Sintesis DNA merupakan proses perbanyakan DNA dengan cara pemanasan kembali pada suhu sekitar 72 OC. Ketiga tahap ini terus-menerus berulang sampai tiga puluh kali ulangan untuk mendapatkan sekitar satu miliar copy potongan DNA (Aljanabi & Martinez 1997).

TUJUAN

Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui cara perbanyakan DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR).

PEMBAHASAN

Percobaan ini bertujuan mengetahui cara perbanyakan DNA dengan PCR (polymerase chain reaction). Perbanyak DNA melalui PCR hanya menggunakan sedikit fragmen DNA untuk menghasilkan berjuta-juta copy DNA. Prinsip kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA tertentu dari seluruh untaian DNA, baik yang berasal dari DNA sel inti (nukleus) maupun organel sel seperti DNA mitokondria (mtDNA) atau Ribosom (rDNA).

Komponen-komponen yang diperlukan untuk PCR antara lain template DNA, primer, DNA polymerase, Deoxynucleotide Triphosphate (dntp), dan konsentrasi Mg2+. Template DNA merupakan molekul DNA utas ganda yang mengandung sequen target yang akan diamplifikasi. Pasangan primer terdiri dari 2 oligonukleotida yang mengandung 18-28 nukleotida dan mempunyai 40-60% GC content. DNA polymerase yang biasa digunakan Taq polymerase yang stabil pada suhu tinggi karena enzim ini diisolasi dari Thermus aquaticus yang hidup pada sumber air panas. Deoxynucleotide Triphosphate (dntp) terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP sebagai bahan untuk mensintesis untai DNA komplementer dengan konsentrasi masing-masing dntp sebesar 20-200 iM menghasilkan keseimbangan optimal antara hasil, spesifitas, dan ketepatan PCR. Konsentrasi Mg2+ mempengaruhi annealing primer, suhu pemisahan untai template dan produk PCR, spesifitas produk, pembentukan primer-dimer, serta aktivitas dan ketepatan enzim (Sulistyaningsih 2007).

Terdapat tiga tahap yang harus dilalui dalam perbanyakan DNA melalui PCR, yaitu pra denaturasi, denaturasi, annealing, elongasi, dan post elongasi. Pada percobaan masing0masing tahapan dalam PCR diseting berdasarkan suhu dan waktu yang diperlukan. Pada tahap pra denaturasi dan denaturasi, suhu dan waktu yang digunakan masing-masing sebesar 95OC selama 5 menit. Pada tahap annealing suhu yang digunakan 55OC selama 1 menit. Pada elongasi dan pra elongasi suhu dan waktu yang digunakan masing-masing sebesar 72OC selama 1 menit. pada tahap denaturasi, annealing, dan elongasi dilakukan atau diulang hingga 30 siklus untuk menghasilkan berjuta-juta copy DNA.

Pada percobaan pita DNA yang digunakan berukuran 2 bp. Menurut literature, melalui PCR akan dihasilkan berjuta-juta pita yang berukuran spesifik 1300 bp dan ditentukan ketika elongasi dengan perincian 1 menit bertambah 1000 bp. Dari hasil percobaan (gambar 1) terlihat bahwa pita DNA yang terlihat hanya pada kelompok 1, 3, 5, 9, 11, dan 15 running. Sedangkan pada kelompok sisanya tidak running atau tidak terlihat. Ini dapat disebabkan karena densitas DNA yang terlalu ringan sehingga tidak terlihat pergerakan DNA, pemberian pewarna tidak optimal, atau karena masalah teknis lainnya.

Penggunaan PCR memiliki banyak keuntungan yaitu dapat mengcopy berjuta-juta DNA dari sedikit fragmen DNA dalam waktu yang relatif singkat, sensitivitas dan spesifitas tinggi, dapat mendeteksi dan membedakan varian mikroorganisme, dan sebagainya. Disamping kelebihan tersebut, terdapat beberapa keterbatasan penggunaan PCR seperti harus dilakukan oleh seorang operator yang memiliki keahlian khusus dan berpengalaman, teknik prosedur yang kompleks, peralatan dan reagen yang digunakan mahal, dan sebagainya (Sulistyaningsih 2007).

Simpulan

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan metode yang digunakan untuk perbanyak DNA yang hanya memerlukan sedikit fragmen DNA untuk menghasilkan berjuta-juta copy DNA dalam waktu yang relative singkat. Hasil percobaan pada kelompok 23 tidak berhasil, ini dapat terlihat dari gambar 1 di mana pada sumur ke-14 tidak terbentuk pita. Ketidakberhasilan ini dapat terjadi karena kesalah teknis dan sistematis. Kelebihan dan keterbatasan PCR antara lain dapat memperbanyak fragmen DNA dalam waktu yang relative singkat, memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi, memerlukan tenanga ahli dan berpengalaman, prosedur yang digunakan kompleks, serta peralatan dan reagen yang digunakan mahal.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s