Ligasi dan Transformasi DNA

LIGASI DAN TRANSFORMASI

PENDAHULUAN

Teknologi DNA rekombinan atau teknik rekayasa genetika banyak digunakan untuk perbanyakan gen tertentu di dalam sel yang bukan sel alaminya  sehingga sering disebut sebagai Kloning gen. Dalam bidang genetika, kloning merupakan replikasi segmen DNA tanpa melalui proses seksual. Sedangkan teknologi DNA rekombinan merupakan pembentukan kombinasi materi ganetik baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme yang berperan sebagai sel inang (Thalib 2009).

Secara teoritis prosedur dan mekanisme kloning atau rekombinasi DNA melalui empat tahap, yaitu isolasi fragmen DNA, ligasi fragmen DNA ke dalam vektor, transformasi dan seleksi hasil kloning. Isolasi DNA merupakan cara yang dilakukan untuk memperoleh DNA dalam suatu organisme. Ligasi merupakan proses penyisipan atau penyambungan molekul fragmen DNA dengan molekul DNA vektor, biasanya ligasi terjadi antara ujung gugus fosfat dengan gugus hidroksil. Transformasi merupakan cara yang digunakan untuk memanipulasi DNA bakteri agar diperoleh sifat yang diinginkan, yaitu menjadikan bakteri mampu menyerap molekul DNA yang berada di lingkungan atau disebut juga sel kompeten (Febrin 2010).

Sel kompeten merupakan sel inang yang memiliki kompetensi untuk memasuki vektor kloning. Beberapa perlakuan yang dapat dilakukan untuk memasukkan sel kompeten antara lain menggunakan metode kejutan panas (heat shock) atau metode kejutan pulsa listrik (electroporation). Untuk mengetahui sel kompeten atau sel yang telah mengalami transformasi maka dilakukan seleksi transforman dengan memanfaatkan sifat yang dibawa sebagai marka seleksi. Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung ampisilin atau melalui ekspresi gen (Sambrook et al. 1989).

TUJUAN

Percobaan ini bertujuan untuk melakukan penyambungan dua fragmen DNA dan mengetahui cara introduksi DNA ke dalam E. coli.

PEMBAHASAN

Ligasi merupakan proses peyisipan atau penggabungan fragmen DNA dengan DNA vektor. Penyambungan fragmen DNA mengikuti kaedah Chargaff, yaitu basa T bepasangan dengan basa A, sedangkan basa G berpasangan dengan basa C. Terdapat tiga cara yang dapat dilakukuan untuk meligasikan fragmen-fragmen DNA secara in vitro, yaitu pertama menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri, kedua menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofage T4 atau disebut juga enzim T4 ligase, dan ketiga memberi enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis utas tunggal homopolimerik 3’ (Sajidan 2008).

Pada percobaan ligasi digunakan perbandingan insert dan vektor (3:1). Penambahan insert atau gen target yang lebih banyak dibandingkan dengan vektor bertujuan untuk memperbesar peluang gen target berikatan dengan vektor (Anam 2010). Suhu optimum untuk aktivitas DNA ligase pada 30OC. Namun, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4OC dan 15OC dengan waktu inkubasi yang diperpanjang atau semalam (Rifai 2011). Hasil dari percobaan ligasi akan digunakan untuk proses transformasi bakteri sehingga akan terlihat keberhasilan proses ligasi pada proses transformasi.

Pada percobaan transformasi, proses transformasi terjadi saat dilakukan heat shock dengan bantuan ion kalsium. Ion kalsium berfungsi sebagai ion yang membantu terbukanya protein integral sebagai kanal ion yang dimanfaatkan sebagai tempat keluar masuknya plasmid ke dalam sel inang (bakteri E. coli). Waktu yang dibutuhkan hanya beberapa detik, karena apabila terlalu lama ada kemungkinan plasmid yang telah masuk dapat keluar kembali. Hal terpenting dalam transformasi adalah perlakuan kalsium klorid (CaCl2) yang memungkinkan sel-sel E. coli untuk mengambil DNA (Muladno 2002). Kalsium klorid terdapat dalam komposisi larutan transformation buffer (TB).

Transformasi merupakan kelanjutan dari proses ligasi. Sebelum melakukan proses transformasi, dibuat suatu kontrol untuk mengetahui keberhasilannya. Kontrol yang dibuat antara lain kontrol positif, kontrol negatif, dan IPTG dan X-gal. Kontrol positif dibuat tanpa menambahkan antibiotik, sehingga dapat mengetahui kemampuan sel kompeten untuk hidup di media tanpa antibiotik atau agen penseleksi. Kontrol negatif dibuat dengan menambahkan antibiotik atau agen penseleksi sehingga dapat menseleksi sel bakteri yang tumbuh pada media tersebut hanya sel yang kompeten. Medium dengan IPTG dan X-gal untuk menguji bahwa IPTG dan X-gal yang digunakan masih bagus. Perbedaan pelakuan di ruang laboratorium dan LAFC (laminar air flow cabinet) berkaitan dengan tingkat aseptikfitas dan keberhasilan transformasi.

Keberhasilan proses transformasi dapat dilihat dari perubahan warna sel atau koloni E. coli yang tersisipi oleh molekul DNA lain atau disebut juga ekspresi gen. Ekspresi gen yang terjadi pada plasmid yang mengandung gen lacZ yang menyandi β-galactosidase akan mengubah molekul X-gal dari tidak berwarna menjadi berwarna biru. Gen lacZ diinduksi oleh IPTG (Isopropil thiogalactoside) sehingga bila gen lacZ tersisipi oleh molukul DNA lain dapat menyebabkan tidak terekspresinya molekul X-gal dan molekul ini menjadi tidak berwarna atau berwarna putih (Anam 2010). Hasil transformasi menunjukkan bahwa gen lacZ pada sel E. coli tersisipi oleh molekul DNA lain sehingga dapat dikatakan bahwa proses transformasi berhasil, begitu pula pada kontrol positif, negatif, serta IPTG dan X-gal di mana sel E. coli berwarna biru. Kesalahan yang mungin terjadi bila hasil tidak sesuai dengan teori, antara lain kesalahan pada proses ligasi, molekul DNA lain tidak menyisip pada gen lacZ dan kesalahan sistematik dalam eksperimen.

SIMPULAN

Percobaan ligasi dan transformasi saling terkait satu sama lain. Keberhasilan ligasi dapat menentukan keberhasilan transformasi, tapi tidak secara mutlak. Hasil ligasi kelompok 23 tidak berhasil atau tidak terlihat adanya pita plasmid yang terbentuk. Pada hasil transformasi kelompok 23 telah berhasil melakukan percobaan dengan benar, ini dapat dilihat dari terbentuknya sel kompeten yang ditandai dengan sel atau koloni bakteri yang tidak berwarna atau berwarna agak keputihan. Sel yang tidak berwarna ini dihasilkan karena gen lacZ pada sel bakteri tersisipi oleh molekul DNA lain sehingga molekul X-gal tidak diekspresikan oleh β-galactosidase yang dikandung gen lacZ.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s